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馬濤，李世昌
(華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200062)
摘要:
綜述了細胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能的研究進展，分析了骨骼肌細胞骨架在維持骨骼肌肌小節(jié)的正常結(jié)構(gòu)和功能中的重要性，重點敘述了骨骼肌細胞骨架蛋白desmin、dystrophin、sarcoglycan、titin和nebulin在運動中的變化，對細胞骨架蛋白在運動性骨骼肌微損傷中的作用進行了討論。
關(guān)鍵詞:細胞骨架；運動性骨骼肌微損傷；綜述
作者簡介:馬濤(1979-)，男，碩士研究生；研究方向:運動性疲勞的機制及恢復(fù)過程。
收稿日期:2006-02-18
1、細胞骨架與骨骼肌細胞骨架蛋白
20世紀60年代以來的研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞質(zhì)中存在著由蛋白纖維構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)———細胞骨架。目前狹義的細胞骨架是指細胞質(zhì)骨架———包括微絲、微管和中間纖維(也稱中間絲)；廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質(zhì)骨架、細胞膜骨架和細胞外基質(zhì)。
微管是細胞內(nèi)的主要支架，并為細胞內(nèi)物質(zhì)運輸指引方向。微絲維持細胞形態(tài)特征，使細胞能夠運動和收縮。微絲由兩條螺旋鏈形成，直徑約7nm，分子質(zhì)量為43u。微絲的每一條鏈均由肌動蛋白組成的多聚體蛋白纖維絲組成，又叫肌動蛋白纖維，或叫纖維型肌動蛋白。除肌動蛋白外，大約100多種其他類型的微絲結(jié)合蛋白質(zhì)與微絲的功能有關(guān)。在肌肉細胞，由肌動蛋白纖維組成的微絲參與形成肌原纖維的細肌絲和肌肉收縮。
中間纖維是一類形態(tài)相似，化學(xué)組成不同的中等徑纖維蛋白質(zhì)的組裝體，直徑介于8～11nm，在細胞內(nèi)和細胞間的連接和支撐上發(fā)揮重要作用，可增加細胞的機械強度，使細胞具有張力和抗剪切力。主要分布在細胞內(nèi)承受機械作用力較大的部位如骨骼肌的Z線周圍。
細胞骨架的作用不僅在于維持細胞形態(tài)穩(wěn)定，而且還參與了調(diào)節(jié)細胞的重要生命活動，如細胞的物質(zhì)運輸、能量與信息傳遞、基因表達、細胞的分裂分化以及凋亡等。
細胞骨架蛋白是骨骼肌細胞具有重要功能的結(jié)構(gòu)。它們的主要功能是連結(jié)和錨定細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)成分。利用快速冷凍蝕刻技術(shù)可見，細胞質(zhì)充滿長度和直徑不等的纖維，它們相互交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細胞骨架網(wǎng)中含有肌動蛋白纖維，微管和中間絲蛋白纖維，這些纖維的交聯(lián)方式非常復(fù)雜。核糖體、細胞器被錨定在細胞骨架上。
骨骼肌細胞骨架按位置不同可分類為肌節(jié)內(nèi)骨架、肌節(jié)外骨架和肌細胞膜骨架。
細胞膜骨架包括膜和與膜相連的蛋白，例如vinculin、spectrin、dystrophin、transmembraneintegrins、ankyrin。這些蛋白間接地將細胞內(nèi)的基質(zhì)與細胞外的特殊區(qū)域連接到一起。
titin和nebulin是肌節(jié)內(nèi)細胞骨架的主要成分，它們沿肌原纖維長軸排列在肌節(jié)內(nèi)。Titin從Z盤伸展到M帶，1983年，Lashall等采用免疫電鏡初次發(fā)現(xiàn)titin的定位，現(xiàn)在認為tinin是連接Z盤和肌球蛋白纖維之間的蛋白絲，從Z盤至M帶，在肌節(jié)中具有一定的彈性，并維持肌球蛋白纖維的中間狀態(tài)。
Nebulin在細胞中的定位是1988年發(fā)現(xiàn)的，在肌肉放松的狀態(tài)下，nebulin起源于Z盤，延伸至I帶，連接于Z盤與Z盤之間，與A帶中的肌動蛋白平行排列，主要作用是保持肌動蛋白的正常結(jié)構(gòu)。肌節(jié)外細胞骨架主要由中間絲蛋白組成，它位于肌原纖維周圍，連接Z盤，核膜和肌細胞膜之間。在骨骼肌細胞確認的一些中間絲蛋白包括desmin、vimentin、nestin、synemin、paranemin、lamins和cytokeratins。
然而，研究更多的中間絲蛋白是desmin，其位于肌節(jié)Z盤周圍，連接相鄰的Z盤。desmin依靠連接Z線而使單個肌原纖維連接起來，主要作用是限制肌小節(jié)在肌肉收縮時被過分牽拉，并涉及力量的傳導(dǎo)。因此desmin功能的研究已越來越成為運動醫(yī)學(xué)的研究熱點。
2、細胞骨架與EIMD
2.1細胞骨架與EIMD的關(guān)系
運動性骨骼肌微損傷(exercise-induced muscle damage，EIMD)和延遲性肌肉酸痛(delayedonset muscle soreness，DOMS)，多年來一直是運動醫(yī)學(xué)的研究熱點。許多研究已表明，離心收縮引起的肌肉酸痛在運動后2～3d達到高峰，DOMS伴隨著一系列結(jié)構(gòu)的，組織學(xué)的和生物化學(xué)的改變，所以又稱為離心運動后的微損傷。
學(xué)者們從多種不同的角度進行了闡釋，從一早的“組織撕裂”假說，到“能量代謝學(xué)說”和“高機械張力”假說，以及近年來的“鈣離子損傷學(xué)說”和“自由基損傷學(xué)說”等等。
20世紀80年代初，人們開始注意DOMS涉及的形態(tài)學(xué)變化，研究發(fā)現(xiàn)，離心運動引起骨骼肌肌原纖維超微結(jié)構(gòu)中Z線改變。Z線被認為是肌原纖維中尤其易受損的結(jié)構(gòu)，Z線流，Z線模糊，破壞或消失是在離心收縮后肌纖維觀察到的典型特征。隨著研究的深入，超微結(jié)構(gòu)中Z線的變化很自然地讓人們聯(lián)想到維持骨骼肌內(nèi)肌節(jié)和Z線正常形態(tài)的細胞骨架，因為細胞骨架蛋白對維持肌節(jié)的正常結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用。運動過程中，高張力的機械牽拉會使細胞骨架的正常結(jié)構(gòu)受到影響，從而造成肌肉收縮蛋白結(jié)構(gòu)破壞。由此，近幾年來骨骼肌細胞骨架蛋白受到了廣泛的關(guān)注。兩套骨架細絲系統(tǒng)(一個是肌節(jié)內(nèi)系統(tǒng)由titin和nebulin組成，一個是肌節(jié)外系統(tǒng)主要由desmin組成)與肌節(jié)收縮蛋白成分之間的相互作用關(guān)系已很明確，在Z盤水平機械力的整合由desmin中間絲蛋白網(wǎng)和肌節(jié)之間發(fā)生。肌原纖維Z盤被認為是收縮力的，彈性成分的和細胞骨架的結(jié)合點，總之，在主動的和被動的力的傳遞中扮演了一個關(guān)鍵角色。Z盤也被認為是在肌原纖維中尤其薄弱的部分，因此，發(fā)生Z盤流變和Z線模糊的機制可理解為，由于肌肉收縮時肌小節(jié)長度可有1%的變化，肌肉收縮時，肌節(jié)間的運動速度就不一致。根據(jù)Katz速度-力量關(guān)系曲線，在向心收縮時，相鄰的肌節(jié)間所受到的張力的差異只有1%～2%至大張力，而在離心收縮時的差異可達50%，甚至超過肌節(jié)所能承受的至大張力值。離心收縮時這些負荷加在Z盤上，就造成了Z盤流變，Z盤的結(jié)構(gòu)遭到破壞，這或許可以解釋為什么進行劇烈運動尤其是包含離心收縮的運動之后，肌肉會發(fā)生DOMS。除了細胞骨架蛋白desmin、titin和nebulin外，近年來研究較多還有細胞膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan。
2.2中間絲蛋白desmin與EIMD
Desmin是肌肉特異性中間纖維蛋白，主要分布在胞漿，是脊椎動物心肌、骨骼肌和平滑肌細胞骨架的主要成份，desmin連接于相鄰肌原纖維Z線之間，限制肌小節(jié)在肌肉收縮時被過分牽拉。同時也連接線粒體、細胞核和肌膜，也與致密斑、橋粒和其他細胞器形成連接。Desmin在細胞中的分布與功能為研究離心運動造成的骨骼肌損傷機制提供了新的角度。
大量研究表明desmin丟失是骨骼肌運動性微損傷的一個敏感的形態(tài)學(xué)指標。如Friden等發(fā)現(xiàn)運動導(dǎo)致desmin斷裂，并認為細胞骨架蛋白的破壞是導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)變化的重要原因。
Lieber等發(fā)現(xiàn)，離心運動30min后，desmin損失很早在運動后5min或15min發(fā)生，24h更為顯著，此時，收縮蛋白開始降解。并認為desmin損失是離心運動導(dǎo)致肌節(jié)變化的前奏。
Friden等應(yīng)用免疫組化，電鏡技術(shù)分析兔重復(fù)離心收縮后趾長伸肌desmin變化，發(fā)現(xiàn)運動后1h和1、3、7d均見不同程度的desmin陰性纖維，28d則偶見，而1～3d desmin下降更為明顯。
Lieber等報道，肌節(jié)的過度擴展引起胞內(nèi)局部鈣離子濃度升高，激活蛋白酶(如Calpain)，使desmin發(fā)生水解，從而導(dǎo)致肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。同時驗證了Brooks等的假設(shè)，即細胞骨架蛋白的水解是骨骼肌離心收縮損傷的重要原因。Barash等在大鼠離心收縮后取脛前肌進行desmin的含量測定，發(fā)現(xiàn)desmin染色下降在離心運動后12h為大，72h恢復(fù)。有許多學(xué)者都發(fā)現(xiàn)，損傷或大強度離心運動后，出現(xiàn)desmin丟失的現(xiàn)象。
袁建琴等通過免疫組化方法，研究離心運動對大鼠骨骼肌desmin分布和表達的影響，對免疫組化切片進行圖像分析。結(jié)果顯示，離心運動后即刻骨骼肌desmin蛋白表達出現(xiàn)顯著性下降。同時，desmin也和超微結(jié)構(gòu)中M線、A帶、Z線一樣在離心運動后表現(xiàn)出延遲性變化趨勢。表現(xiàn)在力竭后1d，隨著離心運動后的恢復(fù)，desmin免疫組化指標出現(xiàn)持續(xù)性下降。因此他們認為離心運動后即刻desmin下降是損傷早期的表現(xiàn)，且預(yù)示著肌纖維進一步損傷和壞死。肌肉離心收縮后細胞內(nèi)離子代謝異常，誘導(dǎo)細胞骨架破壞，出現(xiàn)desmin纖維絲斷裂，肌原纖維的固定喪失，引起Z線流和A帶紊亂，肌小節(jié)進一步損傷和壞死。所以，中間纖維體系的破壞是離心運動導(dǎo)致骨骼肌損傷的起源。
然而，Carlsson等發(fā)現(xiàn)desmin基因敲除小鼠的骨骼肌細胞的肌原纖維結(jié)構(gòu)與野生型鼠相同。Yu等研究報道，在發(fā)生了DOMS的受試者中，沒有發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞desmin染色丟失，不支持骨骼肌中存在肌纖維降解。
LynnR等觀察到，大鼠連續(xù)下坡跑后股中間肌肌纖維中肌小節(jié)的平均數(shù)目要多于上坡跑者。這間接證明了為什么包含離心收縮的運動可引起肌小節(jié)的增殖。
JiGuoyu等使用免疫組化方法分析人體在離心運動后發(fā)生延遲性肌肉酸痛的情況，在肌肉活檢中驚奇地發(fā)現(xiàn)，沒有肌肉壞死和desmin染色的丟失。高分辨率的免疫組織化學(xué)觀察揭示，在離心運動后2～3d和7～8d的活檢中，肌動蛋白和desmin都局部增多，他們認為這種增多是肌動蛋白和desmin的合成和重新組裝，從而產(chǎn)生新的肌小節(jié)。他們由此推斷離心運動后所發(fā)生的DOMS，是肌原纖維和骨架蛋白的積極再重建，而不是肌原纖維損傷和蛋白降解。其實損傷的骨骼肌隨后開始的修復(fù)和再生階段是一個非常復(fù)雜的過程，此時，局部肌纖維desmin含量增加，參與肌肉重建。新合成的desmin可以加固現(xiàn)存的肌小節(jié)或在消失Z盤的區(qū)域增加新合成的肌小節(jié)。
有研究者認為，增加的desmin可以作為保護機制防止隨后的離心運動誘導(dǎo)損傷，認為新合成的desmin與防止損傷有關(guān)。新合成的desmin遵循胚胎發(fā)育模式，初生成的desmin絲以縱向形式存在，而在肌原纖維紋狀出現(xiàn)后，desmin才變成橫紋形式?？赡苄潞铣傻膁esmin的多數(shù)是并入縱向的中間纖維系統(tǒng)，或是肌小節(jié)生成后縱向的desmin絲還存在一段時間，這樣為肌小節(jié)的過度拉長提供機械加固，或上調(diào)以維持肌小節(jié)長度，也能防止損傷。這個結(jié)果可以解釋為什么重復(fù)低于初次強度的離心運動時，人體很少再發(fā)生肌肉酸痛的現(xiàn)象。
Barash和Feasson等的研究結(jié)果也支持一次大強度的離心運動后肌原纖維再重建的解釋。一般說來，desmin在離心運動導(dǎo)致?lián)p傷過程中的變化，細胞骨架蛋白desmin的丟失發(fā)生在早期，是肌小節(jié)破壞的證據(jù)。運動后1～2d desmin繼續(xù)下降，肌纖維進一步損傷。Desmin大約在運動后第2d出現(xiàn)升高，肌原纖維開始重建。
既然發(fā)現(xiàn)作為維持骨骼肌細胞結(jié)構(gòu)完整性的中間絲蛋白desmin在DOMS中的變化尚存異議，那么，中間絲蛋白desmin在EIMD發(fā)生機制和運動后骨骼肌修復(fù)與恢復(fù)過程中的變化究竟如何？應(yīng)該是值得我們進一步去研究的問題。
2.3細胞膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan與EIMD
在運動過程中，機械力的作用以及自由基的攻擊，使得肌細胞膜完整性遭到破壞。肌細胞膜的損傷是胞漿內(nèi)容物泄漏和胞外鈣離子大量進入的直接原因。由于細胞膜骨架參與維持細胞膜的形狀并協(xié)助質(zhì)膜完成多種生理功能，細胞膜骨架蛋白的的破壞必然影響到細胞膜的完整性。因此對骨骼肌細胞膜尤其是細胞膜骨架蛋白和膜上離子通道的研究引起了學(xué)者們的巨大興趣。近年來研究較多的骨骼肌細胞膜骨架蛋白有dystrophin和sarcoglycan。
Dystrophin是抗肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖復(fù)合物(DGC)的主要成分，DGC跨細胞膜連接著肌細胞內(nèi)骨架蛋白和細胞外的基質(zhì)。這種跨膜復(fù)合物的丟失，分解使收縮引起的肌纖維損傷大大增加，使肌細胞膜損傷導(dǎo)致肌纖維壞死。Lovering和DeDeyne用熒光免疫標記抗體的方法研究了離心收縮后骨骼肌細胞膜骨架蛋白a-actinin、desmin、dystrophin、sarcoglycan、β-spectrin和細胞間質(zhì)蛋白laminin、fibronectin的變化。在離心運動引起的損傷后，肌纖維之間有明顯的dystrophin標記丟失，而其它膜骨架蛋白受影響很小。說明dystrophin尤易受到攻擊，并且可能在力量傳遞中占有重要地位。
Sarcoglycan是一個廣泛分布于膜上的蛋白聚糖復(fù)合物，與DGC相連。人類sarcoglycan基因變異引起下肢帶肌肉營養(yǎng)不良癥，而Dystrophin基因變異引起杜氏或貝克爾肌營養(yǎng)不良癥。L.Feasson、D.Stockholm等人應(yīng)用蛋白免疫印跡分析法研究了離心運動引起的人肌細胞膜損傷的情況，發(fā)現(xiàn)離心收縮使a-sarcoglycan分解、丟失，desmin沒有變化，運動后14d desmin合成增加有顯著性意義，而a-sarcoglycan 14d時蛋白水平仍然處于較低水平，高前進等人在此基礎(chǔ)上研究了小熱休克蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)運動引起Hsp27、aB-晶狀體蛋白表達逐漸增加，運動后1d蛋白表達達峰值，14d仍然處于較高水平，與對照組相比有顯著差異。他們認為a-sarcogiycan屬于DGC復(fù)合物，對穩(wěn)定肌細胞膜起重要作用，雖然a-sarcoglycan表達水平下降的準確意義不明，但是可以肯定其丟失是與內(nèi)容物CK、LDH、肌球蛋白等的泄漏相關(guān)，此結(jié)果是與a-sarcoglycan基因敲除鼠表現(xiàn)出的肌膜完整性喪失，肌力下降，和顯著的DGC不穩(wěn)定的結(jié)果相一致的。a-sarcoglycan蛋白水平的降低也可能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的濃度，因為，a-sarcoglycan有一個細胞外ATPase的活動，其減少時ATP酶增多，進而使P2X受體活動增強，P2X受體是一個非特異性的離子通道，a-sarcoglycan蛋白水平的下降可導(dǎo)致持續(xù)的P2X受體活動，而使胞內(nèi)鈣超載。以上的研究表明了膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在保持細胞膜完整性方面的重要性。他們與運動的關(guān)系還值得進一步深入研究。
2.4 Titin和nebulin與EIMD
Titin和nebulin是肌節(jié)內(nèi)細胞骨架的主要成分，它們沿肌原纖維長軸排列在肌節(jié)內(nèi)。由于它們在保持肌節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能方面的重要作用，我們在研究骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能的同時，有必要對titin和nebulin在運動中的變化做近一步深入的研究。
Clare等發(fā)現(xiàn)，在離心收縮后，在Z盤流的鄰近，肌球蛋白位置脫離肌節(jié)中間，而更接近于某一側(cè)Z盤，由于titin參與維持肌球蛋白的正常位置，因此這可能是由于離心運動導(dǎo)致titin降解或斷裂所致。即高張力牽拉-肌節(jié)內(nèi)骨架titin結(jié)構(gòu)破壞-維持肌球蛋白的作用力小時或減弱-肌球蛋白位置發(fā)生變化-收縮功能下降。Horowits和Podolsky在等張性收縮過程中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。Trappe等讓7名男子進行一次高強度離心膝伸肌抗阻訓(xùn)練，在訓(xùn)練之前和訓(xùn)練之后24h，通過肌肉活檢檢測股外側(cè)肌titin和nebulin的含量變化，發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練之后股外側(cè)肌titin和nebulin的含量分別下降了30%和15%。
遍布于一切細胞(特別是真核細胞)中的骨架系統(tǒng)，不僅是活細胞的支架結(jié)構(gòu)，決定細胞的形狀，賦予強度，而且是對各細胞器乃至某些大分子(如酶及受體)進行空間組織安排的統(tǒng)一基質(zhì)，是能量轉(zhuǎn)換的主要場所。細胞骨架遭到破壞可導(dǎo)致EIMD和DOMS，因為細胞骨架蛋白對維持肌節(jié)的正常結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用。Desmin、titin和nebulin在肌節(jié)內(nèi)的位置決定他們在維持肌節(jié)正常結(jié)構(gòu)和功能的重要性。
細胞膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在維持細胞膜的完整性方面有重要作用，所以這些細胞骨架蛋白的變化是研究EIMD的敏感的形態(tài)學(xué)指標。