尚金星張梅趙自剛
《河北北方學院學報(醫(yī)學版)》2008年06期
【作者單位】：河北北方學院；河北北方學院病理生理學教研室；
【關(guān)鍵詞】缺氧；細胞凋亡；凋亡基因
細胞凋亡（apoptosis）是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導致細胞死亡的過程。大量研究表明，心肌細胞的凋亡可能與組織中抗細胞凋亡基因與促凋亡基因的表達失衡有關(guān)，同時也可受細胞周圍的刺激信號所誘導或抑制。缺氧是因組織供氧減少或利用氧障礙引起細胞發(fā)生代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常變化的病理過程。研究顯示組織缺氧可誘發(fā)細胞凋亡，如復制心肌細胞缺氧模型中可觀察到偽足縮短或消失，緊密的星形心肌細胞變得疏松孤立，呈條索狀；細胞核發(fā)生斷裂，呈分葉、碎片狀，核膜完整包被形成凋亡小體；細胞質(zhì)皺縮，核固縮、深染，染色質(zhì)濃集等主要凋亡形態(tài)變化特征。同時，缺氧也可誘導體外培養(yǎng)的心肌細胞發(fā)生凋亡；李雅莉等認為神經(jīng)元凋亡是腦缺血缺氧損傷的主要形式。探討缺氧致細胞凋亡的發(fā)生機制是臨床干預(yù)缺氧性損傷的基礎(chǔ)，本文綜述其發(fā)生機制。
1線粒體損傷
細胞內(nèi)氧化磷酸化、能量代謝和抗活性氧化均有賴于線粒體的功能。研究表明，缺氧所致的細胞凋亡，均先表現(xiàn)為線粒體功能紊亂，尤其是線粒體跨膜電位(△ψm)的破壞。組織細胞缺氧時，細胞膜離子泵功能障礙，膜通透性增強，膜流動性下降，膜受體功能障礙導致Na+大量內(nèi)流，胞內(nèi)Na+濃度升高，可激活鈉泵增加Na+排出，從而消耗大量ATP，這又進一步增強線粒體氧化磷酸化過程。嚴重缺氧時，ATP生成減少，使鈉泵功能障礙，細胞內(nèi)Na+增多，促進細胞內(nèi)鈉水潴留，導致線粒體膜通透性增加，線粒體腫脹。當線粒體部位的PO2降到臨界點1mmHg時，可抑制線粒體內(nèi)脫氫酶的功能，ATP生成進一步減少，呼吸鏈被破壞。
在凋亡過程中起重要作用的不僅是線粒體呼吸鏈活性的喪失，更重要的是細胞色素C（Cyt C）自線粒體的釋放。Cyt C是一種核編碼的蛋白質(zhì)，分子量約14.5KU，位于線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈復合物Ⅲ和Ⅳ之間，在傳遞電子和ATP生成過程中起重要作用。生理情況下，線粒體內(nèi)膜對物質(zhì)通透具有高度選擇性，CytC很難從內(nèi)膜進入胞質(zhì)中。許多實驗結(jié)果顯示，細胞在各種有害因素如缺血缺氧、自由基生成增多、胞內(nèi)鈣超載等刺激下，通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，或直接使線粒體結(jié)構(gòu)受損，線粒體應(yīng)激，使線粒體內(nèi)外膜間的通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）開放，使凋亡啟動因子如呼吸鏈成分Cyt C自線粒體釋放入胞質(zhì)中。CytC作為一種凋亡誘導蛋白可以激活其他凋亡蛋白的活化，其在細胞質(zhì)中與半脘氨酸蛋白酶-9（caspase-9）酶原、凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activationfactor-1，APAF-1）結(jié)合在一起形成一巨大的復合物，caspase-9得以激活，接著又激活了caspase-3，從而引導細胞進入了不可逆的“被刪除”階段。
線粒體改變引起細胞凋亡已知有5種機制：
①電子傳遞、氧化磷酸化和ATP產(chǎn)生的破壞；
②釋放激活caspases家族的蛋白，如Cyt C；
③改變細胞氧化還原潛能；
④細胞自發(fā)的受Bcl-2抑制的核固縮和DNA裂解依賴線粒體的存在；
⑤線粒體釋放的死亡因子還包括：AIF、Smac/D IABALOAIF、Endo-nuclease G。
2鈣超載
自從Kaiser等發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導的胸腺細胞凋亡與Ca2+內(nèi)流增加有關(guān)以來，越來越多的直接或間接證據(jù)表明胞漿Ca2+濃度上升是細胞凋亡的一個重要事件。Ca2+作為第二信使或死亡信號轉(zhuǎn)導分子，通過參與某些和細胞凋亡相關(guān)的蛋白激酶和核酸酶的活化介導細胞凋亡。缺氧時是導致Ca2+超載常見原因，其機制有：
①缺氧時，鈉泵功能受損，Na+離子大量內(nèi)流，細胞內(nèi)Na+明顯升高，Na+/Ca2+交換蛋白以反向轉(zhuǎn)運的方式將細胞內(nèi)排出、Ca2+進入細胞；
②缺氧時，細胞膜嚴重受損，對Ca2+的通透性大大增加；
③缺氧時產(chǎn)生大量氧自由基，自由基可以造成肌漿網(wǎng)膜損傷，鈣泵功能抑制，使肌漿網(wǎng)攝Ca2+減少，胞漿濃度升高；
④線粒體膜損傷抑制氧化磷酸化過程，使ATP生成減少，細胞膜和肌漿網(wǎng)攝鈣能量供應(yīng)不足，促進鈣超載的發(fā)生。
鈣超載被認為是導致凋亡的重要因素，其主要機制有：
①激活與凋亡有關(guān)的各種酶，包括激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶使DNA降解，導致細胞凋亡；
②激活誘生型一氧化氮合酶，引起NO合成增加，高濃度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脫氨基，引起突變和DNA鏈斷裂；同時NO可降低胞漿的pH，并抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成；NO還增加p53表達及減少細胞ATP合成，NO的這些細胞毒性可導致細胞凋亡；
③激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細胞內(nèi)肽鏈間的?；D(zhuǎn)移，在肽鍵間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體的形成；
④激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，加速細胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；
⑤Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露出核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利于DNA核酸內(nèi)切酶切割DNA。
3自由基損傷
在誘發(fā)細胞凋亡的諸多因素中，內(nèi)源性或外源性因素產(chǎn)生的自由基增多均被證實可誘導細胞凋亡。Tory等通過特異性抑制PC12神經(jīng)細胞系中Cu-Zn-SOD合成，證明SOD活力下降可導致細胞凋亡，這種凋亡是氧自由基誘導的。Lennon等對4種不同造血細胞HL60、U937、Molt-4和Daudi進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接引起細胞凋亡。劉戎等證實ROS可誘導細胞凋亡，抗氧化劑可阻斷細胞凋亡的發(fā)生。缺氧導致的細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，可以增強Ca2+依賴性蛋白激酶的活性，促進自由基的生成，還可以協(xié)同其他因素（如GSH下降）引發(fā)線粒體大量產(chǎn)生ROS。氧自由基化學性質(zhì)活潑，破壞機體正常的氧化/還原的動態(tài)平衡，造成生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)）的氧化損傷，干擾正常的生命活動，形成嚴重的氧化應(yīng)激（oxidative stress）狀態(tài)，機體氧化損傷的后果之一就是誘導細胞凋亡。
自由基可以通過以下途徑導致細胞凋亡：
①氧自由基引起的DNA損傷可激活p53基因；
②氧自由基引起的DNA損傷可活化多聚ADP核酸合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗；
③氧自由基攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，通過脂質(zhì)過氧化作用直接造成細胞膜的損傷；細胞膜中不飽和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化產(chǎn)物過氧羥基24碳四烯酸可誘發(fā)細胞凋亡；
④氧化應(yīng)激激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，也可以產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象；
⑤氧化應(yīng)激引起細胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，可改變細胞膜的通透性使Ca2+內(nèi)流增加；
⑥自由基對線粒體膜的損害導致其通透性和膜電位改變；
⑦氧化應(yīng)激可活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1，加速細胞凋亡相關(guān)的一些基因表達；
⑧氧自由基通過影響某些酶活性蛋白質(zhì)的活性，誘發(fā)細胞凋亡。
4低氧誘導因子-1與p53
近年的研究顯示嚴重或持續(xù)缺氧時，缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可誘導細胞凋亡，Helton等在成年大鼠腦缺氧研究中，發(fā)現(xiàn)敲除大腦HIF-1α基因后可引起凋亡基因表達水平下降，從而減少大腦細胞發(fā)生凋亡。HIF-1是細胞及組織缺氧情況下產(chǎn)生的一種氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，能誘導多種缺氧反應(yīng)性表達，使細胞及組織產(chǎn)生一系列反應(yīng)以適應(yīng)缺氧環(huán)境。HIF-1為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，在缺氧誘導的哺乳動物細胞中廣泛表達，對缺氧具有特異感受性，參與體內(nèi)許多缺氧反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在低氧性肺損傷介導的細胞凋亡中有著重要的作用。HIF是由α和β亞基組成的異二聚體，α亞基表達受低氧誘導，β亞基則屬構(gòu)建型表達。序列同源性α亞基目前認為有三種：HIF-1α、HIF-2α（也稱為EPAS1、MOP2、HLF、HRF）、HIF-3α，三者均受氧調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)HIF活性的功能亞單位，三者在結(jié)構(gòu)和功能上有許多相似之處。而β亞基不受調(diào)節(jié)細胞周期基因p53、p21、Bcl-2蛋白的調(diào)節(jié)，常氧時，HIF-1α通過泛素-蛋白溶解酶體通路降解而幾乎檢測不到，因其t1/2很短（約5min）。但細胞低氧時（如1%氧濃度）其t1/2增加到約30min。HIF-1調(diào)節(jié)的基因涉及細胞能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝及血管的發(fā)生，其介導轉(zhuǎn)錄的基因包括：促紅細胞生成素（Epo）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1和3、血紅素氧化酶l、運鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因及編碼p53、p21、Bcl-2的基因。
缺氧可能是p53常見的生理誘導因素。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)缺氧誘導的凋亡所必需的p53能抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活。p53蛋白是一種定位于細胞核的磷蛋白，能夠促進細胞的終末分化和細胞凋亡，機體各組織均有p53表達，但快速的代謝轉(zhuǎn)換使正常細胞的p53蛋白量維持于低水平。除了與凋亡密切相關(guān)，p53還被證實是一種轉(zhuǎn)錄因子，介導下游基因的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)實驗證實，低氧能增加神經(jīng)細胞、心肌細胞、腫瘤細胞等的凋亡以及凋亡相關(guān)因子p53，Bax表達的顯著變化。國外有學者認為，低氧環(huán)境下產(chǎn)生兩種形式的p53，即野生型p53和突變型p53，分別在細胞凋亡和血管生長過程中發(fā)揮重要作用。有學者證實缺氧可誘導野生型胚胎干細胞p53的表達，但在HIF-1α基因缺陷的胚胎干細胞中，p53蛋白水平則沒有明顯變化，從而推測缺氧時p53蛋白水平的升高是HIF-1α依賴性的。并證實HIF-1α是通過直接結(jié)合p53，增加后者穩(wěn)定性，從而促進細胞發(fā)生凋亡。但Chen D在體外實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α不能直接結(jié)合p53，而是直接與起橋梁作用的p53泛素連接酶Mdm2結(jié)合，HIF-1α通過抑制Mdm2介導的p53降解并阻止Mdm2介導的p53核轉(zhuǎn)移，增加p53穩(wěn)定性?；罨膒53進入核內(nèi)，通過調(diào)控其下游基因p21/Waf1/Cip1和bax的表達，啟動相應(yīng)的細胞信號途徑，或通過誘導線粒體通透性改變而直接轉(zhuǎn)位至線粒體，引起細胞周期停滯，啟動細胞凋亡程序。
5 Fas/Fas L
Fas蛋白是細胞膜上的跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體家族，由胞外外結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿內(nèi)區(qū)域構(gòu)成。作為一個膜受體，F(xiàn)as蛋白可以和T淋巴細胞表面的配體結(jié)合，也可以與抗Fas的抗體結(jié)合，從而啟動細胞凋亡。Fas蛋白介導細胞凋亡的機制可能有：
①Fas L或抗Fas的抗體與Fas蛋白結(jié)合，引起神經(jīng)鞘磷脂酶的活性迅速上升，使神經(jīng)鞘磷脂分解產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺作為第二信使激活相應(yīng)的蛋白激酶，從而誘導細胞凋亡。
②抗Fas抗體或腫瘤壞死因子與Fas蛋白結(jié)合后可以激活I(lǐng)CE（IL-1βconverting enzyme）樣的caspase，后者可以降解H1組蛋白，使染色體松弛，DNA鏈舒展，而暴露出核酸內(nèi)切酶的酶切位點，使DNA鏈更容易被切割。
③Fas蛋白激活后也可以通過Ca2+信號傳遞死亡信息而導致細胞凋亡。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，在FAS/FASL誘導的細胞凋亡過程中，F(xiàn)AS和FAS L交聯(lián)能夠引起細胞內(nèi)ROS含量增加和細胞氧化還原狀態(tài)的改變。Suzuki等用化學熒光指示劑Chemluminescence（該指示劑能與包括O2-、OH、單線氧等各種ROS反應(yīng)）觀察B淋巴瘤細胞株BJAB和Ramos以及T淋巴細胞性白血病細胞株Jurkat在Fas/Fas L交聯(lián)后胞內(nèi)ROS含量變化，發(fā)現(xiàn)Fas/Fas L交聯(lián)引起細胞內(nèi)特異性ROS迅速產(chǎn)生，因此，F(xiàn)as/Fas L還可以通過自由基的作用導致細胞凋亡。
總之，缺氧是許多疾病發(fā)展過程中一個重要的病理過程，細胞凋亡是缺氧損傷的重要形式，缺氧可通過線粒體損傷、Ca2+超載、自由基、HIF-1、p53、Fas/Fas L等多種途徑導致細胞凋亡。