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馬濤，李世昌
(華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200062)
摘要:
綜述了細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展，分析了骨骼肌細(xì)胞骨架在維持骨骼肌肌小節(jié)的正常結(jié)構(gòu)和功能中的重要性，重點(diǎn)敘述了骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白desmin、dystrophin、sarcoglycan、titin和nebulin在運(yùn)動(dòng)中的變化，對(duì)細(xì)胞骨架蛋白在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷中的作用進(jìn)行了討論。
關(guān)鍵詞:細(xì)胞骨架；運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷；綜述
作者簡介:馬濤(1979-)，男，碩士研究生；研究方向:運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制及恢復(fù)過程。
收稿日期:2006-02-18
1、細(xì)胞骨架與骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白
20世紀(jì)60年代以來的研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞質(zhì)中存在著由蛋白纖維構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)———細(xì)胞骨架。目前狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架———包括微絲、微管和中間纖維(也稱中間絲)；廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。
微管是細(xì)胞內(nèi)的主要支架，并為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸指引方向。微絲維持細(xì)胞形態(tài)特征，使細(xì)胞能夠運(yùn)動(dòng)和收縮。微絲由兩條螺旋鏈形成，直徑約7nm，分子質(zhì)量為43u。微絲的每一條鏈均由肌動(dòng)蛋白組成的多聚體蛋白纖維絲組成，又叫肌動(dòng)蛋白纖維，或叫纖維型肌動(dòng)蛋白。除肌動(dòng)蛋白外，大約100多種其他類型的微絲結(jié)合蛋白質(zhì)與微絲的功能有關(guān)。在肌肉細(xì)胞，由肌動(dòng)蛋白纖維組成的微絲參與形成肌原纖維的細(xì)肌絲和肌肉收縮。
中間纖維是一類形態(tài)相似，化學(xué)組成不同的中等徑纖維蛋白質(zhì)的組裝體，直徑介于8～11nm，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的連接和支撐上發(fā)揮重要作用，可增加細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，使細(xì)胞具有張力和抗剪切力。主要分布在細(xì)胞內(nèi)承受機(jī)械作用力較大的部位如骨骼肌的Z線周圍。
細(xì)胞骨架的作用不僅在于維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，而且還參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要生命活動(dòng)，如細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、能量與信息傳遞、基因表達(dá)、細(xì)胞的分裂分化以及凋亡等。
細(xì)胞骨架蛋白是骨骼肌細(xì)胞具有重要功能的結(jié)構(gòu)。它們的主要功能是連結(jié)和錨定細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)成分。利用快速冷凍蝕刻技術(shù)可見，細(xì)胞質(zhì)充滿長度和直徑不等的纖維，它們相互交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞骨架網(wǎng)中含有肌動(dòng)蛋白纖維，微管和中間絲蛋白纖維，這些纖維的交聯(lián)方式非常復(fù)雜。核糖體、細(xì)胞器被錨定在細(xì)胞骨架上。
骨骼肌細(xì)胞骨架按位置不同可分類為肌節(jié)內(nèi)骨架、肌節(jié)外骨架和肌細(xì)胞膜骨架。
細(xì)胞膜骨架包括膜和與膜相連的蛋白，例如vinculin、spectrin、dystrophin、transmembraneintegrins、ankyrin。這些蛋白間接地將細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)與細(xì)胞外的特殊區(qū)域連接到一起。
titin和nebulin是肌節(jié)內(nèi)細(xì)胞骨架的主要成分，它們沿肌原纖維長軸排列在肌節(jié)內(nèi)。Titin從Z盤伸展到M帶，1983年，Lashall等采用免疫電鏡初次發(fā)現(xiàn)titin的定位，現(xiàn)在認(rèn)為tinin是連接Z盤和肌球蛋白纖維之間的蛋白絲，從Z盤至M帶，在肌節(jié)中具有一定的彈性，并維持肌球蛋白纖維的中間狀態(tài)。
Nebulin在細(xì)胞中的定位是1988年發(fā)現(xiàn)的，在肌肉放松的狀態(tài)下，nebulin起源于Z盤，延伸至I帶，連接于Z盤與Z盤之間，與A帶中的肌動(dòng)蛋白平行排列，主要作用是保持肌動(dòng)蛋白的正常結(jié)構(gòu)。肌節(jié)外細(xì)胞骨架主要由中間絲蛋白組成，它位于肌原纖維周圍，連接Z盤，核膜和肌細(xì)胞膜之間。在骨骼肌細(xì)胞確認(rèn)的一些中間絲蛋白包括desmin、vimentin、nestin、synemin、paranemin、lamins和cytokeratins。
然而，研究更多的中間絲蛋白是desmin，其位于肌節(jié)Z盤周圍，連接相鄰的Z盤。desmin依靠連接Z線而使單個(gè)肌原纖維連接起來，主要作用是限制肌小節(jié)在肌肉收縮時(shí)被過分牽拉，并涉及力量的傳導(dǎo)。因此desmin功能的研究已越來越成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。
2、細(xì)胞骨架與EIMD
2.1細(xì)胞骨架與EIMD的關(guān)系
運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷(exercise-induced muscle damage，EIMD)和延遲性肌肉酸痛(delayedonset muscle soreness，DOMS)，多年來一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。許多研究已表明，離心收縮引起的肌肉酸痛在運(yùn)動(dòng)后2～3d達(dá)到高峰，DOMS伴隨著一系列結(jié)構(gòu)的，組織學(xué)的和生物化學(xué)的改變，所以又稱為離心運(yùn)動(dòng)后的微損傷。
學(xué)者們從多種不同的角度進(jìn)行了闡釋，從一早的“組織撕裂”假說，到“能量代謝學(xué)說”和“高機(jī)械張力”假說，以及近年來的“鈣離子損傷學(xué)說”和“自由基損傷學(xué)說”等等。
20世紀(jì)80年代初，人們開始注意DOMS涉及的形態(tài)學(xué)變化，研究發(fā)現(xiàn)，離心運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌肌原纖維超微結(jié)構(gòu)中Z線改變。Z線被認(rèn)為是肌原纖維中尤其易受損的結(jié)構(gòu)，Z線流，Z線模糊，破壞或消失是在離心收縮后肌纖維觀察到的典型特征。隨著研究的深入，超微結(jié)構(gòu)中Z線的變化很自然地讓人們聯(lián)想到維持骨骼肌內(nèi)肌節(jié)和Z線正常形態(tài)的細(xì)胞骨架，因?yàn)榧?xì)胞骨架蛋白對(duì)維持肌節(jié)的正常結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用。運(yùn)動(dòng)過程中，高張力的機(jī)械牽拉會(huì)使細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)受到影響，從而造成肌肉收縮蛋白結(jié)構(gòu)破壞。由此，近幾年來骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白受到了廣泛的關(guān)注。兩套骨架細(xì)絲系統(tǒng)(一個(gè)是肌節(jié)內(nèi)系統(tǒng)由titin和nebulin組成，一個(gè)是肌節(jié)外系統(tǒng)主要由desmin組成)與肌節(jié)收縮蛋白成分之間的相互作用關(guān)系已很明確，在Z盤水平機(jī)械力的整合由desmin中間絲蛋白網(wǎng)和肌節(jié)之間發(fā)生。肌原纖維Z盤被認(rèn)為是收縮力的，彈性成分的和細(xì)胞骨架的結(jié)合點(diǎn)，總之，在主動(dòng)的和被動(dòng)的力的傳遞中扮演了一個(gè)關(guān)鍵角色。Z盤也被認(rèn)為是在肌原纖維中尤其薄弱的部分，因此，發(fā)生Z盤流變和Z線模糊的機(jī)制可理解為，由于肌肉收縮時(shí)肌小節(jié)長度可有1%的變化，肌肉收縮時(shí)，肌節(jié)間的運(yùn)動(dòng)速度就不一致。根據(jù)Katz速度-力量關(guān)系曲線，在向心收縮時(shí)，相鄰的肌節(jié)間所受到的張力的差異只有1%～2%至大張力，而在離心收縮時(shí)的差異可達(dá)50%，甚至超過肌節(jié)所能承受的至大張力值。離心收縮時(shí)這些負(fù)荷加在Z盤上，就造成了Z盤流變，Z盤的結(jié)構(gòu)遭到破壞，這或許可以解釋為什么進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)尤其是包含離心收縮的運(yùn)動(dòng)之后，肌肉會(huì)發(fā)生DOMS。除了細(xì)胞骨架蛋白desmin、titin和nebulin外，近年來研究較多還有細(xì)胞膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan。
2.2中間絲蛋白desmin與EIMD
Desmin是肌肉特異性中間纖維蛋白，主要分布在胞漿，是脊椎動(dòng)物心肌、骨骼肌和平滑肌細(xì)胞骨架的主要成份，desmin連接于相鄰肌原纖維Z線之間，限制肌小節(jié)在肌肉收縮時(shí)被過分牽拉。同時(shí)也連接線粒體、細(xì)胞核和肌膜，也與致密斑、橋粒和其他細(xì)胞器形成連接。Desmin在細(xì)胞中的分布與功能為研究離心運(yùn)動(dòng)造成的骨骼肌損傷機(jī)制提供了新的角度。
大量研究表明desmin丟失是骨骼肌運(yùn)動(dòng)性微損傷的一個(gè)敏感的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。如Friden等發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致desmin斷裂，并認(rèn)為細(xì)胞骨架蛋白的破壞是導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)變化的重要原因。
Lieber等發(fā)現(xiàn)，離心運(yùn)動(dòng)30min后，desmin損失很早在運(yùn)動(dòng)后5min或15min發(fā)生，24h更為顯著，此時(shí)，收縮蛋白開始降解。并認(rèn)為desmin損失是離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌節(jié)變化的前奏。
Friden等應(yīng)用免疫組化，電鏡技術(shù)分析兔重復(fù)離心收縮后趾長伸肌desmin變化，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后1h和1、3、7d均見不同程度的desmin陰性纖維，28d則偶見，而1～3d desmin下降更為明顯。
Lieber等報(bào)道，肌節(jié)的過度擴(kuò)展引起胞內(nèi)局部鈣離子濃度升高，激活蛋白酶(如Calpain)，使desmin發(fā)生水解，從而導(dǎo)致肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。同時(shí)驗(yàn)證了Brooks等的假設(shè)，即細(xì)胞骨架蛋白的水解是骨骼肌離心收縮損傷的重要原因。Barash等在大鼠離心收縮后取脛前肌進(jìn)行desmin的含量測定，發(fā)現(xiàn)desmin染色下降在離心運(yùn)動(dòng)后12h為大，72h恢復(fù)。有許多學(xué)者都發(fā)現(xiàn)，損傷或大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)后，出現(xiàn)desmin丟失的現(xiàn)象。
袁建琴等通過免疫組化方法，研究離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌desmin分布和表達(dá)的影響，對(duì)免疫組化切片進(jìn)行圖像分析。結(jié)果顯示，離心運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌desmin蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性下降。同時(shí)，desmin也和超微結(jié)構(gòu)中M線、A帶、Z線一樣在離心運(yùn)動(dòng)后表現(xiàn)出延遲性變化趨勢(shì)。表現(xiàn)在力竭后1d，隨著離心運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù)，desmin免疫組化指標(biāo)出現(xiàn)持續(xù)性下降。因此他們認(rèn)為離心運(yùn)動(dòng)后即刻desmin下降是損傷早期的表現(xiàn)，且預(yù)示著肌纖維進(jìn)一步損傷和壞死。肌肉離心收縮后細(xì)胞內(nèi)離子代謝異常，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架破壞，出現(xiàn)desmin纖維絲斷裂，肌原纖維的固定喪失，引起Z線流和A帶紊亂，肌小節(jié)進(jìn)一步損傷和壞死。所以，中間纖維體系的破壞是離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌損傷的起源。
然而，Carlsson等發(fā)現(xiàn)desmin基因敲除小鼠的骨骼肌細(xì)胞的肌原纖維結(jié)構(gòu)與野生型鼠相同。Yu等研究報(bào)道，在發(fā)生了DOMS的受試者中，沒有發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞desmin染色丟失，不支持骨骼肌中存在肌纖維降解。
LynnR等觀察到，大鼠連續(xù)下坡跑后股中間肌肌纖維中肌小節(jié)的平均數(shù)目要多于上坡跑者。這間接證明了為什么包含離心收縮的運(yùn)動(dòng)可引起肌小節(jié)的增殖。
JiGuoyu等使用免疫組化方法分析人體在離心運(yùn)動(dòng)后發(fā)生延遲性肌肉酸痛的情況，在肌肉活檢中驚奇地發(fā)現(xiàn)，沒有肌肉壞死和desmin染色的丟失。高分辨率的免疫組織化學(xué)觀察揭示，在離心運(yùn)動(dòng)后2～3d和7～8d的活檢中，肌動(dòng)蛋白和desmin都局部增多，他們認(rèn)為這種增多是肌動(dòng)蛋白和desmin的合成和重新組裝，從而產(chǎn)生新的肌小節(jié)。他們由此推斷離心運(yùn)動(dòng)后所發(fā)生的DOMS，是肌原纖維和骨架蛋白的積極再重建，而不是肌原纖維損傷和蛋白降解。其實(shí)損傷的骨骼肌隨后開始的修復(fù)和再生階段是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，此時(shí)，局部肌纖維desmin含量增加，參與肌肉重建。新合成的desmin可以加固現(xiàn)存的肌小節(jié)或在消失Z盤的區(qū)域增加新合成的肌小節(jié)。
有研究者認(rèn)為，增加的desmin可以作為保護(hù)機(jī)制防止隨后的離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)損傷，認(rèn)為新合成的desmin與防止損傷有關(guān)。新合成的desmin遵循胚胎發(fā)育模式，初生成的desmin絲以縱向形式存在，而在肌原纖維紋狀出現(xiàn)后，desmin才變成橫紋形式。可能新合成的desmin的多數(shù)是并入縱向的中間纖維系統(tǒng)，或是肌小節(jié)生成后縱向的desmin絲還存在一段時(shí)間，這樣為肌小節(jié)的過度拉長提供機(jī)械加固，或上調(diào)以維持肌小節(jié)長度，也能防止損傷。這個(gè)結(jié)果可以解釋為什么重復(fù)低于初次強(qiáng)度的離心運(yùn)動(dòng)時(shí)，人體很少再發(fā)生肌肉酸痛的現(xiàn)象。
Barash和Feasson等的研究結(jié)果也支持一次大強(qiáng)度的離心運(yùn)動(dòng)后肌原纖維再重建的解釋。一般說來，desmin在離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致?lián)p傷過程中的變化，細(xì)胞骨架蛋白desmin的丟失發(fā)生在早期，是肌小節(jié)破壞的證據(jù)。運(yùn)動(dòng)后1～2d desmin繼續(xù)下降，肌纖維進(jìn)一步損傷。Desmin大約在運(yùn)動(dòng)后第2d出現(xiàn)升高，肌原纖維開始重建。
既然發(fā)現(xiàn)作為維持骨骼肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的中間絲蛋白desmin在DOMS中的變化尚存異議，那么，中間絲蛋白desmin在EIMD發(fā)生機(jī)制和運(yùn)動(dòng)后骨骼肌修復(fù)與恢復(fù)過程中的變化究竟如何？應(yīng)該是值得我們進(jìn)一步去研究的問題。
2.3細(xì)胞膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan與EIMD
在運(yùn)動(dòng)過程中，機(jī)械力的作用以及自由基的攻擊，使得肌細(xì)胞膜完整性遭到破壞。肌細(xì)胞膜的損傷是胞漿內(nèi)容物泄漏和胞外鈣離子大量進(jìn)入的直接原因。由于細(xì)胞膜骨架參與維持細(xì)胞膜的形狀并協(xié)助質(zhì)膜完成多種生理功能，細(xì)胞膜骨架蛋白的的破壞必然影響到細(xì)胞膜的完整性。因此對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜尤其是細(xì)胞膜骨架蛋白和膜上離子通道的研究引起了學(xué)者們的巨大興趣。近年來研究較多的骨骼肌細(xì)胞膜骨架蛋白有dystrophin和sarcoglycan。
Dystrophin是抗肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖復(fù)合物(DGC)的主要成分，DGC跨細(xì)胞膜連接著肌細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白和細(xì)胞外的基質(zhì)。這種跨膜復(fù)合物的丟失，分解使收縮引起的肌纖維損傷大大增加，使肌細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致肌纖維壞死。Lovering和DeDeyne用熒光免疫標(biāo)記抗體的方法研究了離心收縮后骨骼肌細(xì)胞膜骨架蛋白a-actinin、desmin、dystrophin、sarcoglycan、β-spectrin和細(xì)胞間質(zhì)蛋白laminin、fibronectin的變化。在離心運(yùn)動(dòng)引起的損傷后，肌纖維之間有明顯的dystrophin標(biāo)記丟失，而其它膜骨架蛋白受影響很小。說明dystrophin尤易受到攻擊，并且可能在力量傳遞中占有重要地位。
Sarcoglycan是一個(gè)廣泛分布于膜上的蛋白聚糖復(fù)合物，與DGC相連。人類sarcoglycan基因變異引起下肢帶肌肉營養(yǎng)不良癥，而Dystrophin基因變異引起杜氏或貝克爾肌營養(yǎng)不良癥。L.Feasson、D.Stockholm等人應(yīng)用蛋白免疫印跡分析法研究了離心運(yùn)動(dòng)引起的人肌細(xì)胞膜損傷的情況，發(fā)現(xiàn)離心收縮使a-sarcoglycan分解、丟失，desmin沒有變化，運(yùn)動(dòng)后14d desmin合成增加有顯著性意義，而a-sarcoglycan 14d時(shí)蛋白水平仍然處于較低水平，高前進(jìn)等人在此基礎(chǔ)上研究了小熱休克蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)引起Hsp27、aB-晶狀體蛋白表達(dá)逐漸增加，運(yùn)動(dòng)后1d蛋白表達(dá)達(dá)峰值，14d仍然處于較高水平，與對(duì)照組相比有顯著差異。他們認(rèn)為a-sarcogiycan屬于DGC復(fù)合物，對(duì)穩(wěn)定肌細(xì)胞膜起重要作用，雖然a-sarcoglycan表達(dá)水平下降的準(zhǔn)確意義不明，但是可以肯定其丟失是與內(nèi)容物CK、LDH、肌球蛋白等的泄漏相關(guān)，此結(jié)果是與a-sarcoglycan基因敲除鼠表現(xiàn)出的肌膜完整性喪失，肌力下降，和顯著的DGC不穩(wěn)定的結(jié)果相一致的。a-sarcoglycan蛋白水平的降低也可能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，因?yàn)?，a-sarcoglycan有一個(gè)細(xì)胞外ATPase的活動(dòng)，其減少時(shí)ATP酶增多，進(jìn)而使P2X受體活動(dòng)增強(qiáng)，P2X受體是一個(gè)非特異性的離子通道，a-sarcoglycan蛋白水平的下降可導(dǎo)致持續(xù)的P2X受體活動(dòng)，而使胞內(nèi)鈣超載。以上的研究表明了膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在保持細(xì)胞膜完整性方面的重要性。他們與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系還值得進(jìn)一步深入研究。
2.4 Titin和nebulin與EIMD
Titin和nebulin是肌節(jié)內(nèi)細(xì)胞骨架的主要成分，它們沿肌原纖維長軸排列在肌節(jié)內(nèi)。由于它們?cè)诒３旨」?jié)的結(jié)構(gòu)和功能方面的重要作用，我們?cè)谘芯抗趋兰〉慕Y(jié)構(gòu)和功能的同時(shí)，有必要對(duì)titin和nebulin在運(yùn)動(dòng)中的變化做近一步深入的研究。
Clare等發(fā)現(xiàn)，在離心收縮后，在Z盤流的鄰近，肌球蛋白位置脫離肌節(jié)中間，而更接近于某一側(cè)Z盤，由于titin參與維持肌球蛋白的正常位置，因此這可能是由于離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致titin降解或斷裂所致。即高張力牽拉-肌節(jié)內(nèi)骨架titin結(jié)構(gòu)破壞-維持肌球蛋白的作用力小時(shí)或減弱-肌球蛋白位置發(fā)生變化-收縮功能下降。Horowits和Podolsky在等張性收縮過程中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。Trappe等讓7名男子進(jìn)行一次高強(qiáng)度離心膝伸肌抗阻訓(xùn)練，在訓(xùn)練之前和訓(xùn)練之后24h，通過肌肉活檢檢測股外側(cè)肌titin和nebulin的含量變化，發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練之后股外側(cè)肌titin和nebulin的含量分別下降了30%和15%。
遍布于一切細(xì)胞(特別是真核細(xì)胞)中的骨架系統(tǒng)，不僅是活細(xì)胞的支架結(jié)構(gòu)，決定細(xì)胞的形狀，賦予強(qiáng)度，而且是對(duì)各細(xì)胞器乃至某些大分子(如酶及受體)進(jìn)行空間組織安排的統(tǒng)一基質(zhì)，是能量轉(zhuǎn)換的主要場所。細(xì)胞骨架遭到破壞可導(dǎo)致EIMD和DOMS，因?yàn)榧?xì)胞骨架蛋白對(duì)維持肌節(jié)的正常結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用。Desmin、titin和nebulin在肌節(jié)內(nèi)的位置決定他們?cè)诰S持肌節(jié)正常結(jié)構(gòu)和功能的重要性。
細(xì)胞膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在維持細(xì)胞膜的完整性方面有重要作用，所以這些細(xì)胞骨架蛋白的變化是研究EIMD的敏感的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。