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尤壽江石際俊張艷林劉春風(fēng)
《中國(guó)病理生理雜志》2011年01期
【作者單位】：蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；
蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所衰老與神經(jīng)疾病實(shí)驗(yàn)室；
傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，活性氧類(reactive oxygen species，ROS)只是一類損傷細(xì)胞的毒性物質(zhì)，近年的研究發(fā)現(xiàn)ROS作為一種信號(hào)分子參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多個(gè)生理過(guò)程。自噬是一種溶酶體依賴性的細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的降解過(guò)程，不僅在生理情況下發(fā)揮重要作用且參與一些疾病的發(fā)生發(fā)展。新的研究表明ROS，特別是線粒體源性ROS，作為信號(hào)分子參與自噬的調(diào)節(jié)。本文集中討論了ROS和自噬的關(guān)系以及ROS介導(dǎo)的自噬在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。
1 ROS和氧化應(yīng)激
ROS是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，包括超氧陰離子(O2·-)、自由基(超氧化物、羥基自由基)和過(guò)氧化物(過(guò)氧化氫，H2O2)等。這些物質(zhì)可來(lái)源于生物分子的電離輻射、體內(nèi)一些酶如NADPH氧化酶(NOX)和雙重氧化酶(DUOX)等的合成，同時(shí)線粒體在正常氧化呼吸時(shí)也會(huì)產(chǎn)生少量的ROS，如超氧化物及H2O2。在生理狀態(tài)下，胞內(nèi)的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及鈣信號(hào)參與了ROS產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，低水平的ROS通常能夠被一些抗氧化的酶或物質(zhì)降解，如谷胱甘肽(胞內(nèi)氧化還原的主要緩沖物質(zhì))、硫氧蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等。所以ROS產(chǎn)生和降解平衡的維持對(duì)于細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能具有非常重要的意義。
如果胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)不能夠有效降解ROS，就使得ROS在胞內(nèi)蓄積從而引起氧化應(yīng)激。蓄積的ROS氧化胞內(nèi)的DNA、蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞器。被ROS氧化的蛋白及脂質(zhì)不僅失去應(yīng)有的功能而且易于在胞內(nèi)聚集，形成脂褐素等毒性物質(zhì)，并通過(guò)影響溶酶體的活性而引起細(xì)胞死亡引。另外，氧化應(yīng)激也引起線粒體的嚴(yán)重?fù)p害，線粒體內(nèi)積聚的ROS可以使其DNA突變、脂質(zhì)過(guò)氧化以及線粒體膜通道的開(kāi)放，從而影響線粒體的功能。氧化導(dǎo)致的線粒體膜滲透性通道的開(kāi)放導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加，引起線粒體內(nèi)ATP及Ca2+含量下降，致使線粒體腫脹及細(xì)胞色素C的釋放。研究認(rèn)為線粒體此種嚴(yán)重的損害可以引起自噬、自噬性細(xì)胞死亡、凋亡和壞死。
2自噬
自噬是生物體通過(guò)溶酶體或囊泡降解胞內(nèi)成分的總稱，不但在細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程中起重要作用，而且在應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激時(shí)也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
自噬主要有3種形式：大自噬(macroautophagy)即所謂的自噬、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。大自噬通過(guò)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞漿內(nèi)物質(zhì)，如蛋白及細(xì)胞器，形成自噬囊泡，自噬體的外膜或者液泡膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的水解酶降解其包裹的底物。小自噬是溶酶體膜通過(guò)內(nèi)吞作用直接包裹胞漿內(nèi)物質(zhì)。CMA途徑只能選擇性降解帶有特定信號(hào)基序賴-苯丙-谷-精-谷氨酰胺序列(KFERQ)的胞漿蛋白，胞漿內(nèi)的伴侶蛋白特異性地識(shí)別這種信號(hào)基序然后與溶酶體膜上的受體溶酶體結(jié)合性膜蛋白2a(lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a)結(jié)合從而將底物轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)降解。
盡管，自噬起初被認(rèn)為是非選擇性的降解過(guò)程，但目前的研究認(rèn)為自噬可以通過(guò)優(yōu)先降解胞內(nèi)過(guò)多的細(xì)胞器即選擇性自噬，如過(guò)氧物酶體自噬（pexophagy)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬(reticulophagy）和線粒體自噬(mitophagy）等，從而在機(jī)體應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中和氧化十分密切的是線粒體自噬。
3自噬在機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激過(guò)程中的雙重作用
近年，自噬既可以保護(hù)細(xì)胞又可以引起細(xì)胞死亡的雙重作用已被人們廣泛接受。同樣，在氧化應(yīng)激時(shí)自噬也發(fā)揮著雙重作用。在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生多種防御機(jī)制：上調(diào)抗氧化劑的水平、通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)降解特定的蛋白、通過(guò)自噬來(lái)降解已損傷的蛋白和細(xì)胞器。
一方面自噬的優(yōu)先激活通過(guò)清除氧化的蛋白及損傷的細(xì)胞器而有利于細(xì)胞的存活。過(guò)多的ROS及其它物質(zhì)可以通過(guò)優(yōu)先激活線粒體自噬選擇性地降解氧化損傷的線粒體，從而減輕其對(duì)細(xì)胞的損害。過(guò)多的ROS可以誘導(dǎo)及加強(qiáng)CMA途徑對(duì)氧化蛋白的清除，因?yàn)檠趸牡鞍紫啾任囱趸牡鞍赘淄ㄟ^(guò)分子伴侶轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)，而且在較弱的氧化應(yīng)激情況下溶酶體更易結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)CMA底物蛋白，從而有利于細(xì)胞存活。同樣自噬在清除正常衰老細(xì)胞中過(guò)多氧化的蛋白發(fā)揮重要作用，但隨著年齡的增長(zhǎng)自噬的活性下降，不能夠有效地清除氧化的蛋白，導(dǎo)致衰老及一些老年性疾病，如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)、糖尿病等的發(fā)生。
另一方面自噬可以直接誘導(dǎo)被氧化細(xì)胞的死亡。以往的研究認(rèn)為，在氧化應(yīng)激較強(qiáng)時(shí)，凋亡和壞死的機(jī)制就會(huì)被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
4 ROS在自噬激活中的作用
4．1 ROS作為一個(gè)信號(hào)分子參與細(xì)胞的自噬性死亡
ROS作為一種胞內(nèi)信號(hào)分子參與胞內(nèi)許多生物過(guò)程，參與細(xì)胞增殖、凋亡、免疫及抗微生物過(guò)程。在神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF)缺乏情況下，ROS初次被證實(shí)作為一種信號(hào)分子參與神經(jīng)細(xì)胞的自噬性細(xì)胞死亡(autophagiecell death，ACD)。NGF的缺陷導(dǎo)致大量ROS在神經(jīng)元線粒體內(nèi)蓄積，ROS通過(guò)引起線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化，線粒體功能異常，終引起自噬性細(xì)胞死亡。通過(guò)敲除自噬關(guān)鍵基因beclin 1和自噬相關(guān)蛋白7(Atg7)，發(fā)現(xiàn)NGF缺陷導(dǎo)致細(xì)胞死亡減少，進(jìn)一步明確自噬參與其中，且證明H2O2是誘導(dǎo)這種自噬性死亡有效而且必需的。應(yīng)用抑制線粒體氧化呼吸鏈的藥物如魚藤酮可以使線粒體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS引起自噬性細(xì)胞死亡。以上研究表明ROS作為信號(hào)分子通過(guò)誘導(dǎo)自噬參與了細(xì)胞的死亡。目前還并不清楚具體參與這些白噬性細(xì)胞死亡的ROS，但有學(xué)者認(rèn)為可能有多種ROS同時(shí)參與其中，如O2·-和H2O2。
研究發(fā)現(xiàn)自噬的激活又可以加劇ROS的蓄積。Caspase抑制劑可以導(dǎo)致自噬選擇性地優(yōu)先降解過(guò)氧化氫酶，導(dǎo)致線粒細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積并終引起細(xì)胞死亡。通過(guò)ROS蓄積和自噬之間反饋環(huán)路的假說(shuō)可以解釋這一現(xiàn)象：低水平的ROS激活自噬，自噬的激活降解過(guò)氧化氫酶反過(guò)來(lái)又可以增加H2O2的水平，H2O2的增加進(jìn)一步激活自噬。這些結(jié)果表明，過(guò)氧化氫酶的降解或許導(dǎo)致H2O2信號(hào)的延長(zhǎng)，在自噬性存活向自噬性死亡轉(zhuǎn)化過(guò)程中起重要作用。
4．2 ROS參與細(xì)胞的自噬性存活
近期的研究發(fā)現(xiàn)ROS也參與饑餓誘導(dǎo)自噬的調(diào)節(jié)，而這種自噬的激活有利于細(xì)胞的存活。在饑餓時(shí)，通過(guò)Ⅲ型PI3K-mTOR途徑引起線粒體內(nèi)H2O2蓄積從而激活自噬。
饑餓誘導(dǎo)的氧化信號(hào)在饑餓的早期就會(huì)出現(xiàn)，H2O2通過(guò)氧化底物自噬相關(guān)蛋白4(Atg4)發(fā)揮作用。Atg4是自噬途徑中重要的蛋白之一，其功能是切割泛素樣蛋白家族自噬相關(guān)蛋白8(Atg8)蛋白的c末端，Atg8是一個(gè)與自噬溶酶體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合的重要的物質(zhì)。Atg4只能切割與溶酶體膜共價(jià)結(jié)合的Atg8，切割形成的游離的Atg8在胞漿中可以循環(huán)利用。而氧化的Atg4則不能夠切割與溶酶體膜共價(jià)結(jié)合的Atg8從而誘導(dǎo)自噬的激活。在這個(gè)過(guò)程中Atg4是ROS誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞存活信號(hào)通路中的一個(gè)中間物質(zhì)。進(jìn)一步的研究認(rèn)為H2O2相比其它ROS信號(hào)更有優(yōu)勢(shì)：H2O2相對(duì)穩(wěn)定，壽命長(zhǎng)及作為一種中性離子更易通過(guò)線粒體膜。然而，仍然不清楚的是在這條途徑中Atg4是否是H2O2的僅有底物?Atg4的抑制僅存在于饑餓誘導(dǎo)的自噬還是存在于所有的白噬途徑中?
既然ROS參與了自噬的調(diào)節(jié)，那么ROS信號(hào)的來(lái)源是什么呢?目前的研究認(rèn)為參與自噬調(diào)節(jié)的ROS主要來(lái)源于線粒體。ROS的產(chǎn)生和降解之間平衡的破壞是線粒體內(nèi)ROS聚集的主要原因。大量研究表明，線粒體產(chǎn)生的ROS可以誘導(dǎo)自噬：
(1)應(yīng)用rotenone、4，4，4-三氟-1-[2-噻吩]-1-3-丁烷二酮（thenoyltrifluomacetone，TTFA)、H2O2或2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)等抑制線粒體膜的呼吸鏈復(fù)合體可以誘導(dǎo)線粒體內(nèi)ROS蓄積，從而引起細(xì)胞的自噬性死亡；
(2)雷帕霉素和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nervegrowth factor，NGF)缺乏使得線粒體膜脂質(zhì)氧化從而上調(diào)自噬；
(3)營(yíng)養(yǎng)缺陷誘導(dǎo)ROS蓄積所致的自噬激活也與線粒體密切相關(guān)。
因此，我們推測(cè)線粒體可以作為誘導(dǎo)自噬的氧化還原信號(hào)的來(lái)源。
4．3線粒體在自噬體形成中的作用
線粒體可以通過(guò)產(chǎn)生ROS調(diào)節(jié)自噬體的形成，然而其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)是否只能通過(guò)ROS產(chǎn)物起作用呢?有研究顯示，在酵母中自噬相關(guān)蛋白9(Atg9)(與自噬相關(guān)的兩個(gè)胞膜內(nèi)蛋白之一)在前自噬溶酶體結(jié)構(gòu)及其周圍結(jié)構(gòu)之間循環(huán)，這表明自噬體形成過(guò)程中存在膜成分的循環(huán)利用；同時(shí)位于周圍的Atg9活性結(jié)構(gòu)存在于線粒體附近。已明確哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)Atg9亞型且這兩個(gè)亞型都參與自噬溶酶體膜的合成，同時(shí)線粒體也參與其中。
據(jù)以上的研究可知線粒體是自噬誘導(dǎo)信號(hào)ROS的主要來(lái)源之一，同時(shí)可能還提供部分自噬溶酶體膜合成的原料。線粒體來(lái)源的ROS轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿產(chǎn)生一個(gè)氧化梯度，同時(shí)氧化其底物分子如Atg4及一些未知的分子，氧化的Atg4失去活性不能切割自噬溶酶體膜結(jié)合的Atg8，從而誘導(dǎo)自噬的激活。因?yàn)镽OS是一類短壽命的物質(zhì)，氧化過(guò)程只能在線粒體周邊，而在遠(yuǎn)離線粒體的Atg4具有活性并可以分離位于自噬體上的底物Atg8使其參與循環(huán)利用。然而，目前還沒(méi)有儀器能夠檢測(cè)氧化梯度的變化從而證實(shí)這種推測(cè)。
5 ROS介導(dǎo)的自噬與疾病
ROS介導(dǎo)的自噬不僅與正常的老化相關(guān)，而且可以直接導(dǎo)致或加劇一些疾病的發(fā)生發(fā)展。一些與氧化有關(guān)的疾病中溶酶體系統(tǒng)功能受損起重要作用，如動(dòng)脈粥樣硬化、AD和PD。雖然這些疾病在后期階段有著共同類似的改變即未消化物質(zhì)在溶酶體內(nèi)蓄積，但起初的氧化蛋白進(jìn)入溶酶體的途徑各不相同。
5．1 ROS介導(dǎo)的自噬與動(dòng)脈粥樣硬化
動(dòng)脈粥樣硬化斑塊源自血管系統(tǒng)內(nèi)溶酶體應(yīng)對(duì)氧化損傷的反應(yīng)。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇聚集到動(dòng)脈壁內(nèi)，隨后巨噬細(xì)胞遷移到膽固醇積聚的位置通過(guò)溶酶體來(lái)包裹清除氧化的蛋白。至后巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體堿性化導(dǎo)致溶酶體內(nèi)未降解物質(zhì)的積聚，巨噬細(xì)胞充滿了超載的溶酶體，成為吞噬活性有限的“泡沫細(xì)胞”。研究表明氧化的膽固醇及ROS在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，氧化的膽固醇通過(guò)損傷溶酶體從而影響自噬對(duì)于泡沫細(xì)胞的清除，而ROS隨著損傷細(xì)胞及胞外碎片的積聚而增加，從而使病變一直存在，我們的課題組通過(guò)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞證實(shí)大自噬確實(shí)參與對(duì)ox-LDL的降解，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起著重要的作用。
5．2 ROS介導(dǎo)自噬和阿爾茨海默病
AD是老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，它的病理學(xué)特征為胞內(nèi)具有毒性的肽片段Aβ-42的聚集。研究表明在Aβ-42聚集的早期就發(fā)現(xiàn)有大自噬的激活，并作為一種保護(hù)性機(jī)制阻止細(xì)胞進(jìn)一步損害。隨著疾病的進(jìn)展一方面自噬的活性下降且自噬溶酶體的融合障礙；另一方面Aβ-42抑制溶酶體的降解功能使聚集很快達(dá)到毒性水平，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)產(chǎn)生ROS。而過(guò)多的ROS可以抑制自噬體對(duì)其內(nèi)物質(zhì)的降解從而加劇內(nèi)容物的積聚，使溶酶體膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度改變并引起細(xì)胞死亡。盡管ROS參與了自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但其在AD發(fā)病中的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明。
5．3 ROS介導(dǎo)的自噬與PD
PD是以黑質(zhì)致密部和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)主要含有聚集α-synuclein的包涵體-Lewy小體為病理標(biāo)志的神經(jīng)變性疾病。多巴胺非常容易被氧化，胞內(nèi)和胞外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DA的氧化與α-synuclein的積聚相關(guān)。大量研究表明，自噬參與了α-synuclein的降解過(guò)程：野生型α-synuclein蛋白通過(guò)CMA途徑降解，當(dāng)α-synuclein過(guò)表達(dá)時(shí)，大自噬通常被誘導(dǎo)來(lái)彌補(bǔ)CMA缺陷。我們課題組通過(guò)構(gòu)建表達(dá)突變型α-synuclein的PC12細(xì)胞系(A53T和A30P)，分別給于自噬誘導(dǎo)劑——雷帕霉素和抑制劑——渥曼青霉素，證實(shí)了在PD細(xì)胞模型中自噬水平的增高，促進(jìn)自噬有助于細(xì)胞的存活。予以MPP+處理野生型、A30P和A53TPC12細(xì)胞，結(jié)果顯示野生型的α-synuclein可以抑制MPP+誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，而在A30P和A53T突變的PD模型細(xì)胞中，MPP+可以明顯增加ROS的產(chǎn)生，這表明ROS在α-synuclein的產(chǎn)生和清除中發(fā)揮著重要作用。
6結(jié)語(yǔ)
自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是在分化過(guò)程中促使細(xì)胞進(jìn)行重新組織的需要而產(chǎn)生的，所以自噬與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展均密切相關(guān)。目前的研究表明ROS可以作為一些疾病治療的新靶點(diǎn)，具有潛在的治療價(jià)值。對(duì)于因自噬體的數(shù)量及活力下降引起的與蛋白降解障礙相關(guān)的老年性疾病，如PD、AD、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等，可以通過(guò)上調(diào)ROS水平從而激活自噬來(lái)降解這些蛋白達(dá)到防治疾病的目的。同時(shí)ROS對(duì)于腫瘤的研究和治療也有很大的價(jià)值，已有研究證實(shí)一些藥物可以通過(guò)引起ROS增多而上調(diào)自噬以殺傷腫瘤細(xì)胞。盡管ROS，特別是線粒體來(lái)源的，是調(diào)節(jié)自噬過(guò)程的一種信號(hào)分子，但其誘導(dǎo)自噬的具體機(jī)制和通路還不是很清楚，ROS誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞存活和死亡之間的關(guān)系仍待于進(jìn)一步研究。