周崧易靜
《細胞生物學雜志》2006年05期
【作者單位】:上海交通大學醫(yī)學院細胞生物學教研室
【摘要】:
活性氧(reactive oxygen species,ROS)是生物體內一類活性含氧化合物的總稱,主要包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等。細胞內有多種部位能生成ROS,主要包括線粒體、內質網、NADPH氧化酶復合體、脂氧合酶系、環(huán)氧合酶系等。靜息條件下,細胞內ROS的水平被控制在很低的范圍。而在細胞受到各種生理或病理因素作用時,當多種細胞外信號分子作用于其膜受體,ROS生成可以受到受體活化的誘導而“有目的”地快速增加,從而作為細胞內信號分子參與細胞增殖,分化和凋亡等各種細胞行為。
活性氧(reactive oxygen species,ROS),特別是諸如超氧陰離子(O2·-)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2),作為生命體有氧代謝的中間產物,多年來主要被看作對大分子有損傷作用的毒性物質。ROS對細胞有益的概念先是被作為動物機體防御系統(tǒng)的重要組成部分而提出的,早期的工作重的重要組成部分而提出的,早期的工作重點主要集中在中性粒細胞等吞噬細胞的呼吸爆發(fā)產生的ROS作為毒性分子對病菌的殺傷上,同時也涉及細胞內高濃度ROS的生成對細胞的殺傷作用。然而,研究證明,ROS有作為細胞內信號分子所擁有的各種特性,如:
(1)當細胞受特定刺激,或受到細胞外信號分子如配體激發(fā)時能快速生成;
(2)能在細胞內快速擴散;
(3)生成后能引起該細胞或臨近細胞的特定行為;
(4)在需要關閉或復原時能通過多種途徑迅速移除信號;等等。
近年來的研究發(fā)現,ROS作為一種重要細胞內信號分子參與了細胞增殖、分化和凋亡,以及許多重要的細胞行為。ROS在靜息細胞內的生成速率主要受到生成部位的代謝狀態(tài)和氧還狀態(tài)的制衡,此時細胞內ROS被控制在一個很低的范圍內,一旦細胞受到相關配體信號激發(fā),往往伴隨著細胞內ROS水平的迅速提升,繼而產生細胞內一系列的信號轉導?,F就目前BOS在細胞內的生成部位以及受到細胞外信號分子誘導后ROS的生成機制的研究進展進行簡要論述。
1細胞內ROS的生成部位
細胞內ROS主要依賴細胞質膜和內膜上氧化酶生成。原則上,任何涉及電子傳遞的蛋白質或酶系都能導致“副產物”ROS的生成。由于細胞內強大的還原系統(tǒng)的存在,大多數非“目的性”生成的ROS多被立即清除以保持胞內氧化還原狀態(tài)的平衡。
1.1呼吸鏈
線粒體是細胞內很大的ROS產地。在胞內還原環(huán)境下,大約有1%~2%的O2耗在呼吸鏈酶復合體Ⅰ和Ⅲ處被漏出的電子還原成為ROS也就是說,線粒體的電子漏是細胞內ROS的主要來源。但是由于線粒體內高濃度的SOD存在,以及生成的O2·-其自身擴散出膜能力差,只有少量形成的H2O2擴散入胞漿,胞漿ROS水平被控制在一個低而穩(wěn)定的水平。
過去對這部分ROS參與細胞信號轉導并不重視,近來有證據顯示TNF-α和IL-1介導的細胞凋亡為線粒體源ROS所調控。TNF-α能激活細胞線粒體生理性解偶聯機制,通過使連接呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅲ的CoQ半醌形式(QH)穩(wěn)定性增加,從而增加ROS生成、促進線粒體腫脹以及細胞色素c釋放,導致細胞凋亡。另外,有報道提出在受抗原刺激下擴增T細胞的凋亡過程存在兩條途徑,分別為活化誘導的細胞死亡(activation-inducedcell death AICD)和活化T細胞的自發(fā)死亡(activated T-cell autonmnousdeath ACAD),這兩條途徑都有可能受到線粒體源的ROS所調控。
在對心肌細胞缺血再灌的研究中發(fā)現,細胞內產生的高濃度ROS能通過PKC和MAPK途徑誘導蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphotasa PIP)持續(xù)激活使線粒體腫脹,而細胞通過線粒體體積依賴型和非依賴型兩條途徑抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的合成,提高了細胞對ROS的敏感閾從而起到保護細胞的作用。
線粒體作為氧感受器介導缺氧所誘導的基因轉錄也需要ROS參與。新近有研究顯示,在整合素介導的細胞信號中,線粒體來源的ROS能啟動細胞分化,起到抗凋亡的作用。
1.2內質網(ER)
ER是細胞內另一個生成ROS的膜性細胞器。不同于線粒體,ER中的細胞色素P-450和b5家族通過氧化不飽和脂肪酸和外源生化物質來生成O2-/H2O2。雖然鮮有關于ER生成的ROS和細胞信號之間直接聯系的報道。但有研究證明了ROS能通過改變非受體型酪氨酸激酶活性等途徑影響到ER諸如蛋白質折疊和分泌等的功能。在研究TNF-β介導肝細胞凋亡過程中也發(fā)現線粒體和ER細胞色素P-450 1A1生成的ROS共同參與凋亡的細胞信號過程。
1.3 NADP源化酶復合體
結合在細胞質膜上的NADPR氧化酶復合體是生成ROS的另一個重要部位,也是目前研究發(fā)現大多數生長因子和激酶激發(fā)的ROS生成部位。早對于NADPH氧化酶的研究是基于吞噬細胞的呼吸爆發(fā),其復合體是由質膜上的p22phox、gp91phox組成的細胞色素b558復合體和胞漿中的磷酸化的p47phox、p67phox和p40phox組成,上述成分與兩個激活后由GTP結合的G蛋白p21Rac和Rap1A組裝成活化的氧化酶,產生ROS。
近年來,不斷發(fā)現在成纖維細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、腎系膜細胞、甲狀腺細胞等非吞噬細胞內,存在與吞噬細胞NADPH氧化酶類似的、具有氧化活性的酶,這些酶被叫做Nox。在非吞噬細胞內,ROS的生成遠低于吞噬細胞,常常都顯示對細胞增殖、分化的誘導作用,說明ROS在此扮演是細胞內信號分子的角色。目前認為非吞噬細胞內的ROS生成量低是由于其NADPH氧化酶組成成分的低表達,特別是Nox的含量,大約只有白細胞的1%~3%所致。這些NADPH氧化酶胞質成分與吞噬細胞內的相同,而其主要的活性反應中心細胞色素b558的β亞基gp91phox則存在多種類似物,由于它們功能和結構相近,如都含數個穿膜片段、上有含參與電子傳遞的Fe離子的血紅素結合位點、胞內結構域有FAD和NADPH結合位點,已被歸類為Nox家族,目前發(fā)現的有Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5以及Duox亞族(圖1)。
1.3.1 Nox2
Nox2(Aka,gp91phox)即白細胞內發(fā)現的gp91phox,其結構為一個主要由6個疏水穿膜片段串連而成的大小為91 kDa的糖蛋白,其中胞質端為結合FAD、NADPH的保守位點,電子則由蛋白質中心的2個血紅素傳遞給胞外的氧分子以生成O2-。
1.3.2 Nox1
Nox1(Vbx-1,NOH-1)在人結腸中高表達,在前列腺、子宮和血管平滑肌內次之,與Nox 2有56%的同源性。在血管平滑肌組織中,Nox1在增殖細胞中的表達要遠高于靜止期細胞,并且其表達受到PDGF、ANGⅡ、PGF2α等生長因子的調控,可以推測Nox1與細胞生長以及成血管信號放大有關。新研究表示,雖然在結腸腫瘤組織中存在Nox1的高表達,但尚無證據表明其與腫瘤細胞的增殖有關,可能Nox1在結腸上皮細胞分化中起了其他的作用。
1.3.3 Nox3
Nox3(gp91-3)mRNA過去只被發(fā)現在某些胎兒組織,如腎臟、腦以及頭骨處表達,其結構與Nox2有58%的同源性。新近研究發(fā)現,Nox3在內耳道前庭以及耳蝸上皮細胞內表達。體外實驗發(fā)現在p47phox、p67phox,或在直腸NADPH氧化酶Nox組織物1(Nox organizer 1)和Nox激活物1(Nox activator1)的存在下,Nox3能產生高濃度的ROS推測與耳毒性藥物導致聽力損傷的病理機制有關。
1.3.4 Nox4
Nox4(Renox Kox-1,Kox)存在于人腎皮質,特別是遠端小管上皮細胞和系膜細胞內,與Nox2有39%同源性。近期大量研究表明Nox4作用可能是作為氧感受器調節(jié)EPO的合成以及腎臟細胞的生長和凋亡。對于Nox4的腎外作用,Yang等回發(fā)現Nox4和Nox2存在于小鼠破骨細胞中,可能為骨質重吸收提供一個氧化環(huán)境。
1.3.5 Nox5
Bbx5在睪丸精原細胞以及在淋巴細胞豐富的脾臟和淋巴結內表達。其結構為一種Ca2+激活的gp-91phox蛋白類似物,但僅與NOX2有27%的同源性。其功能除了被鈣激活生成ROS外,還能作為質子通道平衡胞內外電位差和pH值。目前主要觀察到Nox5與精原細胞成熟,如人精子活力及頂體反應的氧化改變有關。另外,在脾臟中,Nox5可能是T、B細胞被激活后產生ROS的部位,介導了T、B細胞的增殖分化。
1.3.6 Duox亞族
Duox亞族包括Duox1(Thox1)和Duox2(Thox2,p138TOX),分別存在于甲狀腺、小腸和結腸中,人類Duox1和Duox2序列有83%相同。在人甲狀腺濾泡中,Duox存在于濾泡細胞尖端表面,因此可能其功能與甲狀腺過氧化酶介導的碘化反應及甲狀腺球蛋白的酪氨酸殘基的交聯有關。Duox2突變造成先天性甲減證明Duox2在甲狀腺素的合成中起到重要的作用,而Duox1在甲狀腺組織中的作用目前還不明確。在人的腮腺導管、結直腸黏液腺和主要氣道壁的黏液腺上也存在Duox,可能其產生的H2O2與乳酸過氧化酶的抗菌作用有關。
1.4脂氧合酶系、環(huán)氧合酶系
脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)和環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)是細胞脂類代謝中將花生四烯酸代謝為脂類過氧化物和ROS的酶類。目前作為細胞信號研究的主要是COX-1、COX-2、5-LOX和12-LOX。它們生成的ROS以及活性氮(RNS),單獨或共同通過多種信號途徑參與改變細胞葡萄糖攝取、受體活性和細胞因子釋放等活動,終可導致細胞死亡。比如,白介素IL-1β在類淋巴細胞激活NF-κB的過程依賴5-LOX產生的ROS。Chiarugi等也發(fā)現參與細胞黏附過程的信號轉導的ROS是由LOX生成的,而非先前認為的由NAPDH氧化酶生成。
1.5其他
另外,核膜上的細胞色素氧化酶系和電子傳遞系統(tǒng)類似于ER膜上的,也能生成ROS。但是據現有研究發(fā)現,核膜電子漏出所產生的ROS對細胞DNA有破壞作用。還有包括γ-谷氨酰轉肽酶、黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系等酶都能產生ROS,但至今還缺乏關于它們參與細胞信號轉導的直接證據。
2信號配體誘導的ROS生成
所有的多細胞生物都是通過一個由胞外和胞內信號組成的高度復雜的信號網絡來控制其一系列的生物學行為,包括生長發(fā)育消亡、內環(huán)境穩(wěn)定、組織損傷的修復等等。細胞外信號通常包括物理性和化學性兩類。所謂化學性的細胞外信號主要指細胞因子、生長因子、激素和神經遞質等。這些信號就是作為配體通過激活細胞表面或細胞內的特異性受體見下述),進而激活胞內信號轉導起到調控細胞行為的作用。在此過程中細胞內ROS快速而一過性升高,與配體-受體相互作用緊密偶聯,往往對后繼的信號轉導發(fā)生介導和調控作用。
2.1 TNF-α受體
TNF-α受體在被TNF-α激活后引起信號轉導過程中生成ROS的現象得到大量報道。關于TNF-α的研究發(fā)現,由TNF-α誘導產生的ROS能激活轉錄因子NF-κB及其基因轉錄,從而調節(jié)細胞的增殖、分化;另一方面,TNF-α介導的細胞凋亡的死亡信號傳遞過程中,caspase-3也能激活線粒體外膜通透性改變、細胞色素c釋放和ROS生成從而對整個凋亡過程起到反饋放大的作用。
目前關于TNF-α膜受體激活線粒體產生ROS的具體機制仍不明確。有報道說,L929細胞TNF-αR55受體在激活后其膜內死亡結構域能誘導線粒體向核周易位和聚集,從而介導細胞凋亡。另外,配體激活后能在胞漿內連接TNFR并誘導其三聚化的TNF受體聯系因子(TRAF2)和受體相互作用蛋白(RIP),為ROS生成和TNF的信號的必須效應分子。
2.2酶聯受體
2.2.1受體酪氨酸激酶(receptortyrosine kinase,RTK)
很多生長因子結合的RTK都能激活ROS生成,通過對胞內信號轉導的加強或氧還狀態(tài)的改變影響細胞內主要的MAPK途徑。其中研究比較早的是血小板來源的生長因子(PDGF)和上皮生長因子(EGF)受體。Sundaresan等在報道了PDGF通過提高胞內H2O2水平誘導酪氨酸磷酸化,從而啟動MAPK信號途徑的機制。Bae等報EGF受體激酶參與了EGF介導的胞內H2O2生成,他們否定了先前EGF受體自磷酸化的理論,闡述了是H2O2通過抑制PTP活性間接激活生長因子受體激酶即RTK活性的。Kamata等也闡述了EGF受體的二聚化或寡聚化依賴H2O2對PTP的抑制的類似觀點。
近年來的研究發(fā)現,很多生長因子受體誘導ROS生成的同時胞內Rac1/Ras水平也相應升高,而Rac1能通過GTP獲能后與NADPH氧化酶的關鍵部分p67phox結合,從而激活NADPH氧化酶生成ROS。因此,生長因子受體自己被激活后通過Rac1激活NADPH氧化酶生成ROS,從而將信號往下游轉導。目前的研究還發(fā)現Rac1活性能通過不同細胞內存在的前饋和反饋機制被放大或關閉,該機制受細胞內氧還狀態(tài)調控。另外,也有報道稱整合素能通過Rac GTPase誘導線粒體HOS生成以改變細胞形態(tài),調控細胞凋亡。目前也有研究表明5-LOX生成ROS是Rac-1介導的又一條細胞信號途徑。
2.2.2受體絲氨酸/蘇氨酸激酶(receptor serine/threoninekinase,RS/TK)
目前在哺乳動物細胞內發(fā)現的所有RS/TK都屬于TGF超家族,它們的作用機制都是通過Ⅰ型和Ⅱ型受體的異源復合體磷酸化激活SMAD蛋白和由該蛋白質介導的細胞信號途徑。目前,已證明有很多細胞在TGF-β1刺激下有ROS生成,并產生多種效應,而ROS的來源可能不是膜上NADPH氧化酶。不同于RTK偶聯的生長因子,大多數TGF-β1都抑制其靶細胞的生長。Shibanuma等報道,在TGF-β1誘導的小鼠成骨細胞在分化過程中的生長抑制和DNA合成減少需要H2O2介導。不過,TGF受體作用生成ROS的直接靶點至今仍未被找到。
2.2.3 G-蛋白偶聯受體
細胞表面受體中大部分就是G-蛋白偶聯受體,其中有很多被發(fā)現能介導ROS生成,例如血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)、5羥色胺(5-HT)、血栓素、內皮素(ET)等的受體。
在血管平滑肌細胞中發(fā)現ANGⅡ能誘導NADH/NADPH氧化酶依賴的ROS生成,并且此事件與高血壓有關。目前已發(fā)現依賴ANGⅡ的ROS生成在生理上能產生多種作用,包括血管收縮、血管平滑肌細胞肥大、細胞存活激酶Akt/PKB的激活、胰島素樣生長因子-1受體的激活和IL-6的生成等。類似過程也見于5-HT。5-HT在血管平滑肌細胞能誘導依賴NADPH氧化酶的ROS生成,而且這種ROS生成是5-HT激活MAPK、誘導基因表達的上游事件。
2.2.4離子通道偶聯受體
神經元快速電興奮信號轉導是通過突觸離子通道快速的開放和關閉實現的,而離子通道偶聯受體的配體大多為神經遞質(乙酰膽堿、5-HT、谷氨酸、α-氨基丁酸等)。目前發(fā)現在神經元細胞內谷氨酸能誘導ROS生成,其機制可能有依賴胞內離子濃度途徑和非依賴胞內離子濃度途徑兩種。有報道說該過程是由胞內Zn2+介導的線粒體去極化,細胞色素c大量釋放使ROS濃度上升導致。在心肌細胞內也發(fā)現乙酰膽堿能激活K-ARP通道開放和線粒體ROS生成以作為細胞信號介導心肌細胞缺血前適應,然而一旦缺血造成過量ROS生成又將誘導心肌細胞的死亡。
3小結
綜上所述,信號配體作用于細胞時往往誘導細胞內ROS快速生成,ROS的來源以質膜NADPH氧化酶為多見,產生的ROS隨即介導了相應的細胞內信號轉導途徑。信號轉導的生物學效應是由配體受體相互作用以及不同信號途徑的相互作用[或稱“串話”(crosstalk)]決定的,但ROS常常參與調控該信號途徑自身轉導和與其他途徑的“串話”,從而對結局施加影響。得益于技術手段的飛速發(fā)展,ROS在細胞內介導細胞增殖分化以及凋亡信號途徑的細節(jié)正在逐步被闡明,某些研究成果也對心血管疾病、糖尿病的治療起到一定的指導作用。但是目前臨床上更多的仍是將高濃度ROS作為一種組織毒性分子對待而予以消除。相信隨著人們對于ROS生成的目的性、特異性以及生成時機、生成量的調控等問題的了解增多,ROS作為細胞內重要的信號分子將得到更為全面和正確的認識。